Mikroskopické metody
ZOBRAZOVACÍ METODY V OPTICKÉ MIKROSKOPII
Prof.RNDr.Antonín Mikš,CSc.
Katedra fyziky, FSv ČVUT, Praha
miks@fsv.cvut.cz
1. Úvod
Jedním z nejrozšířenějších optických přístrojů je mikroskop [2,8], který nachází široké uplatnění v řadě oblastí vědy a techniky. Při studiu vlastností předmětů vyšetřovaných pomocí mikroskopu se používá celé řady technik (metod) a to v závislosti na charakteru vyšetřovaného předmětu. I když je mikroskop znám několik století, dosáhly mikroskopové techniky největšího rozvoje v minulém století.
Při vyšetřování vlastností předmětu pomocí optické (světelné) mikroskopie se využívá elektromagnetické záření jehož vlnová délka se nachází v oblasti vlnových délek zhruba od 180 nm do 1300 nm. Při interakci elektromagnetického záření s vyšetřovaným předmětem dochází ke změně charakteristik záření, kterými jsou: amplituda, polarizace, fáze a frekvence (vlnová délka). Elektromagnetické záření také silově působí na vyšetřovaný předmět a tohoto jevu lze např. využít pro manipulaci s mikroskopickými objekty (optická pinzeta). Jedním z úkolů mikroskopu je kvalitně a věrně zobrazit vyšetřovaný předmět a poskytnout pozorovateli co nejvíce informací o jemné struktuře předmětu, která je jinak okem nerozlišitelná. Úkolem mikroskopových technik je pak poskytnout pozorovateli hlubší a podrobnější kvantitativní informace o struktuře vyšetřovaného předmětu. Je zde třeba zdůraznit, že kvalita získaných informací je zcela závislá na kvalitě optických soustav (objektivů, okulárů, kondenzorů, filtrů apod.) použitých v daném mikroskopu.
2. Mikroskopové metody
Mikroskopové metody [4-15] se vyvíjely postupně a v řadě případů byl jejich rozvoj podmíněn stavem vědy a techniky v daném časovém období. Fyzikálním základem řady mikroskopových metod je princip superpozice elektromagnetických polí jejichž vlastnosti jsou ovlivňovány jednak vyšetřovaným předmětem, jednak řízeným zásahem do vlastností pole (amplituda, polarizace, fáze, frekvence) v závislosti na dané mikroskopové metodě.
- Barvení biologických preparátů
- Temné pole
- Vícebarevné osvětlení
- Šikmé osvětlení
- Fázový kontrast
- Reliéfní fázový kontrast
- Hoffmanův modulační kontrast
- Interferenční kontrast
- Polarizační mikroskopie
- Fluorescence
- TIRFM
- GFP Zelený fluorescenční protein
- FRAP
- FRET
- STED
- Holografická mikroskopie
Existuje ještě celá řada dalších mikroskopových metod jako např. 4Pi mikroskopie [10,11], FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), FSC (Fluorescence Correlation Spectroscopy), SNOM (Scaning Near-field Optical Microscopy) atd., o kterých se zde nebudeme zmiňovat a čtenář najde další informace v [10,13].
Literatura
[1] |
Mikš A.: Aplikovaná optika 10, Vydavatelství ČVUT, Praha 2000. |
[2] |
Fuka J, Havelka B: Optika, SPN, Praha 1961. |
[3] |
Mikš A.: Fyzika 2 – Elektromagnetické pole. Vydavatelství ČVUT, Praha 2005. |
[4] |
Wolf E.: Mikroskopická technika. SZN, Praha 1954. |
[5] |
Zernike F.: Physica 1 (1934), 689-704. |
[6] |
Pawley, J. B. (ed.); Handbook of Biological Confocal Microscopy, Plenum Press (2nd Edition), New York (1995). |
[7] |
Francon M.: Le microscope a contraste de phase et le microscope interférentiel. CNRS, Paris 1954. |
[8] |
Pluta, Maksymilian; Advanced Light Microscopy: Principles and Basic Properties, PWN-Polish Scientific Publishers, Warsaw, vol. 1, vol. 2, and vol. 3 (1988). |
[9] |
Beyer H.: Theorie und praxis des phasenkontrast-verfahren. Akad. Verl. Leipzig 1965. |
[10] |
Springer Handbook of Lasers and Optics (Träger, Frank Ed.). Springer 2007, 1331 |
[11] |
Hell S., Stelzer E.H.K.: Properties of 4Pi confocal fluorescence microscope. J. Opt. Soc. Am. A (1992), Vol.9, No.12, p.2159-2166. |
[12] |
Hell S., Wichmann J.: Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letter (1994), Vol.19, No.11, p.780-782. |
[13] |
https://www.olympusmicro.com/index.html |
[14] |
|
[15] |
https://www.olympusmicro.com/primer/bibliography.html |